Genetically Modified Traits

For thousands of years, intermating among related species combined with selection within the natural    environment has resulted in the creation of new species. The complete set of genetic information for an organism is termed agenome. In plants, there are many examples in nature where entire genomes have been combined to form new species. These species are termed allopolyploids; allo = different,

polyploid=multiple copies of a haploid genome. A number of cultivated plants have originated from this process, including Solanum tubersosum L. (potato, two genomes), Medicago sativa L. (alfalfa, two

genomes), Triticumaestivum L. (wheat, three genomes), and Fragaria xananassa Duchesne (strawberry, four genomes). The creation of these wild allopolyploid species was through natural processes, but

domestication and selection of cultivated varieties from them involved human influence. Following the   combination of genomes, further selection, chromosome rearrangement, and chromosome elimination, can occur within the new species. These processes can also lead to the creation of new uses for old

genes and generate quite different chromosome arrangements from that of the progenitor species.

Humans have also created new plant species from merged genomes and these include triticale, which is a merge of the wheat and rye

(Secale cereal L.) genomes, and Festuca-Lolium which is a merge of

either tall or meadow fescue (Festucaarundinacea Schreb. & F.

pratensis Hud., respectively) with either annual or perennial ryegrass (Loliummultiflorum Lam. & L. perenne L., respectively). Sometimes

laboratory procedures are required to successfully mate distantly

related species; this laboratory process is termed embryo rescue.

Some of you may have tried Cotton CandyTM grapes (Fig. 1); it is a

seedless variety with a caramel taste like cotton candy. If so, you have

Figure 1. Cotton Candy(R) grapes (Vitis

spp.). Source: grapery.biz

eaten a variety developed from embryo rescue. This particular grape variety was developed through the

pollination of a Vitis species hybrid with pollen from the grape variety “Princess” by David Cain,

International Fruit Genetics in Bakersfield, California  (https://www.npr.org/sections/thesalt/2013/08/05/209222126/the-cotton- candy-grape-a-sweet-spin-on-designer-fruit).

Over the past four decades, the process of combining traits and creation of new plant varieties has

become more specific with the advent of genetic engineering technology: the ability to isolate, or create, a DNA sequence of a desired trait and introduce that trait into a species which lacks that trait. Instead of  combining tens of thousands of genes through crossing within a species, and grappling with the

multitude of positive and negative interactions amongst them, only a specific sequence is introduced or altered. This provides greater predictability for the new attribute associated with the new variety.

Varieties that contain a genetic sequence introduced from another species through recombinant DNA

techniques are termed transgenic varieties, genetically modified organisms, or GMO’s. All countries have

regulations governing the introduction of GMO’s. Unlike other countries, Canada’s regulations

encompass a much broader range of genetic alteration. In Canada, plants are regulated on the basis of

the trait expressed and not on the basis of the method used to introduce the trait. In Canada these are     termed “Plants with Novel Traits” (PNT) .  A PNT is defined as a plant that expresses a trait that is both: 1) new to the Canadian environment; and, 2) has the potential to affect the specific use and safety of the

plant with respect to the environment and human health. PNT’s maybe produced by conventional

breeding, mutagenesis, or by recombinant DNA techniques. Following evaluation of the novel trait’s    impact on the environment and food/feed safety, regulatory approval for use of a specific PNT can be granted by the Canadian Food Inspection Agency working in conjunction with Health Canada.

A number of PNT’s have been approved for use in Canada. Many of the approvals are for novel tolerance to herbicides but there are also approvals for traits such as altered fatty acid or amino acid profiles,

insect tolerance, drought tolerance, improved feeding value (HarvXtra® reduced lignin alfalfa), and    longer shelf life (Arctic® non-browning apple). The following links are to the CFIA database listing the approved PNT’sand a list ofPNT’s under reviewby the regulatory agencies

Creation of GM organisms is not restricted to plants. Many traits have been introduced into animals. In

terms of one which has been approved for sale is a genetically

altered Atlantic salmon (Salmo salar L.). Atlantic salmon grow

slowly for their first two years after hatching and only grow

rapidly in the summer. The GM salmon has a growth gene from

a Chinook salmon (Chinook’s grow rapidly after hatching) and a

growth controlling gene from a sea eel (it grows all year round).

The GM salmon grows rapidly after hatching and continues this

growth all year round. This reduces the time required to produce market ready fish by a year (Fig. 2).     The company involved in its development is AquaBounty; they produce eggs in a hatchery in Rollo Bay, PEI and also export to Indiana in the U.S. A story on the sale of GM salmon (AquAdvantage®) in Canada can be foundhere.

Detection of GMO’s

Various methods have been developed in order to identify the gene specific to the PNT/GMO. In plants, these methods are used for quality control to ensure purity of the seed of commerce, for tracking seed  in the production channel, and for use in export and import control.

The most accurate technique requires a laboratory and involves multistage extraction, purification, and detection of the DNA sequence using a procedure called Polymerase Chain Reaction (PCR). A goal of a    number of research teams is to develop a DNA detection kit that can be used onsite. Alas, we are not    there yet.

For certain traits, an antibody detection of the protein product can be used, and many of these can be

used in or outside a lab with a simple antibody assay termed ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent  Assay). The antibody binds to the novel protein of the transgenic trait and a marker colour is used to measure how much antibody has been bound to the protein. The greater the amount of transgenic   protein, the greater will be the binding and the more intense the colour reaction. If there is no

transgenic protein, or the levels are below the detection limit of the assay, there is no colour change.

LAB 7

A) Presentation on Genetically Modified Plants

For first half of this week’s lab there will be a powerpoint presentation, an animation to explain how an ELISA strip assay works, and a short video from Germany which describes how food is tested for the

presence of a genetically modified trait.

During the presentation, consider the following questions. We will NOT betaking up the answers in class so pay attention.

1.   What is meant by the term GM?

2.   Is a PNT different from a GM plant?

3.   What percentage of the soybean crop in Canada is GM: 65, 79, 81, 95% ?

4.   Does Canada require GM labeling of food?

5.   Comparing Japan with the European Union (EU), which is more restrictive in their labeling of GM food?

6.   For detecting the presence of a GMO, which testis preferred: PCR or ELISA?

7.   Which laboratory technique would you use to quantify the level of GM ina food/feed sample (ELISA, PCR, or real-time PCR)?

B) GM Detection Experiment

In this laboratory, you will use an antibody test kit from Agdia, Elkhart IN

(ImmunoStrip® STX 74000/0050) for detection of a specific transgenic protein (Fig. 3). This particular kit can be used to detect the protein product of

Monsanto’s first generation Roundup Ready® (RR) and second generation RR2Y varieties, specifically the protein product of the CP4 EPSP synthase (EPSPS)

gene. This gene has been widely employed in soybeans (Glycine max (L.) Merr.). This is the same gene present in RR alfalfa (Medicago sativa L.), corn (Zea mays  L.), sugarbeet (Beta vulgaris L.), and cotton (Gossypium hirsutum L.). The RR

and RR2Y soybeans have the same CP4 EPSP gene sequence and the exact

same transgene protein, but the two genes differ in their controlling elements and the specific site they have been inserted into the soybean genome.

Figure 3. Agdia test strips for

detecting transgenic proteins.

Source:https://orders.agdia.com/imm unostrip-for-roundup-ready-stx-74000

How the CP4 EPSP synthase gene product works.

Plants, bacteria, and fungi are able to produce the aromatic amino acids (phenylalanine, tyrosine, and

tryptophan) but animals cannot ‐‐ animals need to obtain these amino acids from plant or microbial

sources. EPSP (5‐enolpyruvylshikimate‐3‐phosphate) synthase is a key enzyme in this biosynthetic

pathway; it catalyzes the conversion of shikimate‐3‐phosphate and phosphoenolpyruvate to EPSP

(Fig. 4). The herbicide glyphosate, which is sold by Monsanto Company under their trademark Roundup,

is a competitive inhibitor. The chemical competitively binds to the EPSP synthase enzyme which

prevents it from binding to the substrate. Because the enzyme pathway is blocked, the plant dies from its inability to produce the three amino acids: phenylalanine, tyrosine, and tryptophan.

If glyphosate is applied to a GM plant that contains and expresses the CP4‐EPSPS gene, the glyphosate

will disable the plant’s EPSPS enzyme, but the CP4‐EPSPS enzyme will remain active thus enabling the

plant to continue production of aromatic amino acids. For a more detailed explanation of this enzyme,     see Harrisonetal. (1996). The first couple of paragraphs of their introduction present a summary of how the CP4 EPSP synthase enzyme functions.

References:

Cain, D. 2013. IFG Seven grapevine. US Plant Patent PP23,399. [this is sold under the name Cotton Candy]

Cook, J. T., McNiven, M. A., Richardson, G. F., and Sutterlin, A. M. 2000. Growth rate, body composition and feed

digestibility/conversion of growth-enhanced transgenic Atlantic salmon (Salmo salar L.). Aquaculture 188: 15-32.

De Vries, B. D. and Fehr, W. R. 2011. Impact of the MON89788 event for glyphosate tolerance on agronomic and seed traits of soybean. Crop Sci. 51: 1023-1027.

Harrison, L. A., Bailey, M. R., Naylor, M. W., Ream, J. E., Hammond, B. G., Nida, D. L., Burnette, B. L., Nickson, T. E., Mitsky, T. A., Taylor, M. L., Fuchs. R. L., and Padgette, S. R. 1996. The expressed protein in glyphosate‐tolerant soybean, 5‐

enolpyruvylshikimate‐3‐phosphate synthase from Agrobacterium sp. strain CP4 is rapidly digested in vitro and is not toxic to acutely gavage mice. J. Nutrition 126(3): 728‐740.

Schaad, N.W., Frederick, F., Shaw, J., Schneider, W. L., et al. 2003. Advances in molecular-based diagnostics in meeting crop biosecurity and phytosanitary issues. Ann. Rev. Phytopathology 41: 305-324.

Tan. S., Evans, R., and Singh, B. 2006. Herbicidal inhibitors of amino acid biosynthesis and herbicide tolerant crops. Amino Acids 30: 195-204.

Protocol:

For this laboratory, you will work individually. A blend of seed of the soybean varieties OAC Wallace (a non-GMO  variety)  and  OAC  Challenger   (an  RR2Y  variety)  was   prepared.  Both  varieties   have  been developed by the University of Guelph soybean breeding program. Plants were grown from each variety at a constant 22 °C under a 16 / 8 h light/dark cycle. From the seeds and plants available for your lab section, you will evaluate if they contain the RR gene. Each seed has been given a unique code (letter- number); your TA will indicate which one has been assigned for you to assess. Your Lab section’s results will be combined to form the dataset for the entire experiment.

The objective of this study is to evaluate the efficacy of the strip test for detecting the presence of GM in

a seed lot of soybeans, and to determine the proportion of OAC Wallace and OAC Challenger in the given seed lot. Efficacy can be defined as the capacity for producing a desired result; in this case

detection of RR GMO’s in a population of soybean seeds (Lab 7) and plants (Lab 8).

Seed Extraction:

You will be given one Agdia extraction kit. The extraction bag is filled with 3 ml SEB4 extraction buffer (SEB is an acronym for Sucrose  based  Extraction  Buffer) . The  composition  of the extraction  buffer  is proprietary but contains a phosphate buffer saline solution (0.1 M NaCl, 15 mM  potassium phosphate, pH 7. 2) and protease inhibitors to prevent the degradation of proteins during extraction.  The volume (3 ml) of buffer in the kit results in a 1:20 dilution extraction when 0.15 g of seed is extracted.

Wearing gloves, trim off the top of the extraction bag using scissors to just below the mesh. Place the    seed into the extraction bag between the two layers of mesh, fold over to seal, and depending on what is available, homogenize the seed using a bolt, pliers, small hammer or pestle to crush the seed sample and mix the contents. Be careful not to puncture the bag or spill the contents.

Transgenic protein detection:

Let the extraction sample sit for at least 30 seconds before testing with   the   ImmunoStrip.   Carefully    remove   the   strip   from   the container.  Hold the strip  by the end that  is  labeled with the test name. Keeping the strip vertical, insert the other end of the strip (marked sample) into the extract solution in the bag (Fig. 6) at the one end of the bag that does not have the mesh. Careful you do not remove the strip’s protective covering. The green side should face the plastic, and the smooth reverse against the mesh  Do not allow  more  than  0.5  cm  of  the  strip  to  be  submerged  into  the extract solution. Hold the bag upright during the reaction process.

A  control  line  should  appear  on  the   strip  in  5  minutes.    This indicates that the test strip is working properly. If the control line does not appear, the testis invalid.

Figure 6. Insert no more than the lower 0.5

cm of the strip into the extract solution.

A) GM Experiment Cont’d

A spreadsheet summarizing the results of the Agdia Strip Tests on the seeds (Lab 7) as well as the response of plants to the spray application (Lab 8) will be uploaded to courselink. You will summarize the data using the    table below and include it in your poster.

Table 1. Number of soybean seeds testing positive or negative for

the RR gene using an ELISA test strip, and soybean plants testing

positive  or  negative  for  the  RR  gene  using  a  glyphosate  spray

application.

Test Strip

(seeds)

Glyphosate

Spray

(plants)

For the purposes of this exercise, we will assume that if a seed tested positive for the RR protein, it would produce a plant that is resistant to herbicide application. We will also assume that if a plant was killed by the herbicide application it means that the plant did not have an active RR gene.1 The following are some specific questions you are required to incorporate into your results and discussion for the poster.

1.   For your results section, what percentage tested positive for the RR protein? What percentage of

plants survived the glyphosate application? These values represent the percent of the soybean

population that are GMO and had the transgene. The seeds that tested negative for the RR protein and plants that died after glyphosate application represent the non-GMO populations. Include a

graph comparing the % GMO and non-GMO based on the strip test and spray application. There are no mean or standard error values to calculate as these are categorical variables.

2.   What was the ratio of OAC Wallace (non-GMO) and OAC Challenger R2 (GMO) that was used to blend this seed sample? Do the results of the strip test and spray application agree? Please comment on

these questions in the discussion section of your poster.

3.   Random populations of seeds and plants from the same seed lot were tested for the presence of the RR gene (test strips for seeds, spray application for plants). However, we were unable use the strip

test on a leaf from each plant prior to herbicide application. Is this a limitation of our study? Does this impact the interpretation of the results regarding the efficacy and future use of the test strips? Please comment on this in the discussion section.

Appendix I - Biol*1050 Research Poster Guidelines

The poster is to be submitted as a single document (one file) in pdf format, via the Course Dropbox by the due date. If using Powerpoint (recommended), go to Save As and select PDF and be sure to confirm that your poster looks  correct  (text,  images)  before  submitting.  A template  will  be  provided  on  courselink  but  you  will  have creative freedom on the overall design (font size, colours). Resources will also be provided on courselink providing tips on designing a poster. Posters submitted by email will not be accepted; Late submissions and those not in pdf format will receive a grade of 0.

Your poster must be standard size (48” width x 36” tall) and include the following sections. Use CSE Style outlined in the citation guide for citations/referencing.

1. Title:  Title, name, affiliation (University of Guelph)

2.  Abstract: Single spaced, 150-200 words and in sentence form.

Abstracts are required to be accepted for a poster presentation at a scientific conference. Write this section last as you need to summarize the introduction, methods, results, discussion and conclusion in a concise manner.

3. Introduction: Introduce the species and the topic under investigation.  Cite original sources of information. The  authority must be included with Latin names of species. Include the objective and hypothesis as subheadings. This section can be in sentence form or bullet points.

Note 1: Only peer reviewed papers and government & government agency websites are acceptable sources. Other websites (including university), blogs, etc. are not acceptable sources.

Note 2: Included within the introduction will be the hypothesis and objective of the study under separate subheadings. You may directly use the following sentences to convey these parts of the poster:

The objective of this study was to determine the frequency of the Roundup Ready gene in a soybean seed lot and to determine the efficacy of the Agdia strip test in seed samples compared to the response of

plants to the herbicide glyphosate.

It was hypothesized that the Agdia strip test can be used to detect the level of GM presence in a soybean seed lot.

4. Materials and methods: Based on information provided in the lab manual and procedures carried out in labs 7 and 8. This section be in sentence form or bullet points. See the grading rubric for more information.

5. Results:  Unlike a lab report or scientific paper, the results section of a poster does not usually contain written text. Instead, the data is presented in key tables, graphs, diagrams, graphics and photos which you present to

those interested in your work. Although you will not be presenting your poster, we will stay consistent with this  format. Include the table summarizing the results of the test strips and herbicide application (seepage 8 for the  table format). A graph related to question 1 (page 8) should also be included (column chart or other chart type   since there is no standard error to calculate). You may also include pictures of the test strips and soybean plants (if available) or other relevant imagery. Refer to the grading rubric for more information.

6. Discussion: See the rubric for more details and include the conclusion as a subheading. This section can use bullet points but be sure to address questions 2 and 3 found on page 8 of the manual.

7. References:  See citation guide on how to format this section.